В 1829 году 5 апреля император Николай I подписал Указ об учреждении Новочеркасской (Донской) кафедры. Новая епархия была выделена в самостоятельную из состава Воронежской.
Кафедра в Воронеже сохранялась, а архиерея новой кафедры император повелел титуловать «Донским и Кавказским». Епархия оказалась причисленной к почетному второму классу и поступила в прямое подчинение Московскому патриархату.
Назначению главы новой кафедры предшествовала традиция, когда Синод предлагал царю выбор из трех кандидатов. В случае с Новочеркасском ими стали викарий Санкт-Петербургской епархии епископ Ревельский Никанор, ректор Костромской семинарии архимандрит Евгений и епископ Тамбовский Афанасий. Николай I остановил выбор на тамбовском владыке.
Административные границы Новочеркасской епархии совпадали с границами Области войска Донского.
Важной деталью было то, что Ростов и Таганрог с уездами не подчинялись Новочеркасским архиереям, — тогда они находились в составе Екатеринославской епархии с центром в нынешнем украинском городе Днепр.
Главным храмом стал кафедральный Вознесенский войсковой кафедральный собор.
Епархия просуществовала до 1943 года, когда её основная территория вошла в Ростовскую и Сталинградскую епархии.
